ELISA实验注意事项、技术问题原因汇总（精装版）

ELISA实验注意事项、技术问题原因汇总（精装版）
ELISA测定错误结果的原因分析
ELISA即酶联免疫吸附试验，是一种常用的固相酶免疫测定方法。Engvall 和Perlmann于1971年最先应用该法进行了IgG定量测定，并命名为enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)。 ELISA的基本原理是：
①使抗原（或抗体）结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性；
②使抗原（或抗体）与某种酶联结成酶标抗原（或抗体），而且此酶标抗原（或抗体）既保留其免疫活性，又保留其酶活性；
③测定时将受检标本（抗体或抗原）和酶标抗原（或抗体）按不同步骤与固相载体表面的抗原或抗体进行反应，再用洗涤方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其它物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检的抗体或抗原量成一定比例；再加入酶反应底物后，底物被酶催化后变为有色产物，根据其颜色反应的深浅进行定性或定量分析，以了解被测标本中抗体或抗原含量。
ELISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在临床检验中除正常反应外，有时常可见到一些错误结果（即假阳性或假阴性结果）。引起ELISA测定错误结果的原因主要有：
①标本因素；
②试剂因素；
③操作因素。
本文就标本因素对ELISA测定的影响做如下讨论。
血清是最常用的ELISA标本，血浆一般可视为与血清同等的标本，标本引起的假阳性和假阴性结果主要是干扰性物质所致，分为内源性物质和外源性物质两种：
1． 内源性物质 有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果。常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。
（1）类风湿因子
人血清中IgM、IgG型类风湿因子（RF）可以与ELISA系统中的捕获抗体及酶标记二抗的FC段直接结合，从而导致假阳性。
解决该情况的办法是：
①用F(ab)2替代完整的IgG；
②标本用联有热变性（63℃，10 min）IgG的固相吸附剂处理（将热变性IgG加入到标本稀释液中同样有效）；③检测抗原时，可以用2-巯基乙醇等加入到标本稀释液中，使RF降解。
（2）补体 ELISA系统中固相一抗和标记二抗过程中，抗体分子发生变构，其FC段的补体C1q分子结合位点被暴露出来，使C1q 可以将二者连接起来，从而造成假阳性。解决的办法是：①用EDTA稀释标本；②用53℃，10 min或56℃，30 min加热血清使C1q灭活。
（3）嗜异性抗体 人类血清中含有能与啮齿类动物（如鼠等）Ig (s) 结合的天然嗜异性抗体，可将ELISA系统中一抗和二抗连接起来，也能造成假阳性。解决的办法是：可在标本稀释液中加入过量的动物Ig (s) ，但加入量不足或亚类不同时无效。
（4）嗜靶抗原的自身抗体 抗甲状腺球蛋白、抗胰岛素等嗜靶抗原的自身抗体，有时能与靶抗原结合形成复合物，在ELISA方法中均可干扰抗原抗体测定结果。为避免以上情况出现，解决的办法是：测定前需用理化方法将其解离后再测定。
（5）医源性诱导的抗鼠Ig (s) 抗体 临床开展的用鼠源性CD3等单克隆抗体治疗，用放射性同位素标记鼠源性抗体的影像诊断及靶向治疗等新技术，均有可能使这些病人体内产生抗鼠抗体；另外，被鼠等啮齿类动物咬伤的病人体内也可以产生抗鼠Ig (s) 抗体。这些病人ELISA测定时均可产生假阳性。解决的办法是：测定抗原时，在标本中加入足量的正常鼠Ig (s) ，从而克服由于上述原因造成的假阳性。
（6）交叉反应物质 类地高辛、类AFP样物质等，是与靶抗原有交叉反应的物质。在用多抗测定抗原时对测定结果影响不大，但在用单克隆抗体测定抗原时，如果交叉抗原决定簇正好是所用单克隆抗体相对应的靶决定簇时，也会出现假阳性结果。
（7）标本中其它成分的影响 血清脂质过高、胆红素、血红蛋白及血液粘度过大等，均对ELISA测定结果有干扰作用。
2． 外源性物质
外源性物质常常是由于用于ELISA测定的血标本的采集、贮存等不当所致。如标本溶血、标本被细菌污染、标本贮存过久、标本凝集不全和采血管中添加物等影响。
（1）标本溶血 由于各种人为原因引起的标本溶血，均可因红细胞破坏溶解时释放出大量具有过氧化物酶活性的血红蛋白，在以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，会导致非特异性显色，干扰测定结果。为克服上述干扰作用，标本采集时必须注意避免溶血。
（2）标本受细菌污染 因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。
（3）标本保存不当 在冰箱中保存过久的标本，血清中IgG可聚合成多聚体、AFP可形成二聚体，在间接法ELISA测定中会导致本底过深、甚至造成假阳性；标本放置时间过长（如一天以上），有时抗原或抗体免疫活性减弱，亦可出现假阴性。为克服上述干扰，ELISA测定的血清标本宜为新鲜采集；如不能立即测定，5天内测定的血清标本可存放于4℃，1周后测定的血清标本应低温冻存；冻存后融解的标本，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混合后再测定，但混匀时应轻柔，不可强烈振荡。
（4）标本凝集不全 在没有促凝剂和抗凝剂存在的情况下，正常血液采集后1/2~2h开始凝固，18~24h完全凝固。临床检验工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，此时的血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；这类情况于次日复查时因血凝已完全，血清中不再有纤维蛋白原存在，故复查结果变为阴性。为避免上述干扰作用，解决的办法最好是血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。
（5）标本管中添加物质的影响 抗凝剂（如肝素，EDTA）、酶抑制剂（如NaN3可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性）及快速分离血清的分离胶等均对ELISA测定有一定干扰作用。 综上所述，对临床检验ELISA测定中出现的假阳性或假阴性结果，在考虑试剂因素和操作因素之外，更多的应从标本因素方面进行分析，并应采取相应措施排除干扰作用，从而为临床提供正确可靠的检测结果。

酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题
1、仪器质控
为使仪器保持最佳工作状态，应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）、温箱、洗板机和酶标仪。
◎移液器： ELISA加样量小（20-200μl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±5%以内；
◎恒温箱： 经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；
◎洗板机： 每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超过2μl；人工扣板时，垫纸不湿；定期检查管孔是否堵塞；
◎酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。

2、试剂盒选择
◎应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂应从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性全面评价。
◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对大量样品中阳性检出的能力。
◎特异性：常用交叉反应率表示。含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标。
◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV%，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。
◎准确度：通过添加回收实验进行评价。
◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简单明了，定量试验结果计算也应简单。
◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。
◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格比较合理。
◎试剂评价：需要有权威的确证方法和确证的样品进行检测。

3、样本前处理注意事项
3.1 均质
组织样本:肉、肝食品类切细，用绞肉机反复绞碎，混合均匀。
水产样本：去除样品的非食用部分，食用部分切细，用均质器均浆；原料表面较脏时,需适当用蒸馏水清洗。
蛋类：鲜蛋去壳，蛋黄和蛋白充分混匀。
水果、蔬菜类：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。
3.2 振荡提取
将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中，振荡，使提取溶剂与容器内的样品充分接触以深入到样本组织内部，提取待测组分。
3.2.1振荡方式：振荡器上进行上下、往返式振荡、手摇式上下振荡。
3.2.2 在组织样本中加入有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，防止组织凝结成团，不利于提取。
3.3. 在用有机溶剂提取过程中，如果出现乳化现象，解决的方法有：①用细头轻轻的搅拌，破坏乳化后，再重复离心。②再加入适量的提取剂，重新振荡。注意离心后要保证样本的稀释倍数不变。
3.4 浓缩
由于净化过程中引入的溶剂，可能会降低待测组分的浓度或者不适宜直接分析，需要去除全部有机溶剂。即试剂盒前处理步骤中把样本在60℃氮气下吹干，再用复溶液溶解干燥残留物。
浓缩方式：
氮气吹干除杂、压缩空气吹干除杂。
注意：
3.4.1在吹干样本之前，用甲醇清洗针头，防止杂质干扰。
3.4.2在吹样本时，针头应在液面上空，避免与样本接触，防止产生交叉污染。
3.4.3样本吹干后应立即取下，避免吹的时间过长，影响最终检测结果。
3.4.4不同的药物，吹干后样本的保质期不同，提倡待样本回到室温后立即复溶。
3.5 净化
经过提取的待测组分中通常含有一些会干扰试剂盒中抗原抗体反应的杂质或者是含有与待测物结构相似的杂质。将待测组分与杂质分离的过程，我们称为试剂盒中样本的净化。在我们现有的试剂盒前处理方法中涉及到的最常见的净化是：液液分配法。
比如：用复溶液溶解干燥残留物之前先加入适量的正己烷，在加入正己烷和复溶液涡动后如果出现乳化现象，可以60℃水浴加热，至乳化现象消失或减弱后，加大离心转速进行离心。
实例：
A、氟喹诺酮类药物试剂盒现有的水产样本前处理方法中，用二氯甲烷作为提取剂。
注意：
(a)二氯甲烷的密度比水大，离心完后，二氯甲烷在下层，须先用加样器吸尽上层废液后，再按要求取适量的下层吹干。
(b)在用加样器吸取下层的有机相时，正常操作往往取量不准确，此时最好用带有刻度，且刻度较准确的玻璃管来定量。
(c)上诉情况对有经验的试验员还可以通过灵活控制加样器来控制取样的准确性。
(d)在振荡过程中要注意安全。二氯甲烷在振荡的过程中，如果离心管密封性不是很好，往往容易爆开；在进行振荡时，不要让离心管口对准自己或者其他人，避免溅到自己或者他人身上。
(e)试剂盒在使用前充分回温很必要，如回温不充分该项目曲线受影响较明显。
B、硝基呋喃代谢物检测过程中常见问题
硝基呋喃代谢物有四种：3-氨基-2-唑烷基酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)和1-氨基-2-内酰脲(AHD)在检测过程中也需要同其它项目一样进行添加回收测评，其中需要注意以下几个问题。
代谢物在组织中是与蛋白呈结合状态，采用普通的有机溶剂或缓冲液，是无法提取该代谢物的。需要用盐酸水解后才能使呋喃类代谢物游离，所以在加入去离子水、盐酸和2-硝基苯甲醛(2-NBA)混合均匀后，其pH应在1-3之间，否则不利用水解代谢物。
在衍生化过程中，温度和时间决定其衍生化产率，衍生化后在加入氢氧化钠和磷酸氢二钾时，其pH应在中性左右。由于部分样本的缓冲能力不同，所以需对其pH进行测定，因为在酸性或碱性环境中，不利于呋喃类代谢物的提取回收，同时也容易出现假阳性。
添加回收的几种误区：
呋喃类代谢物提取过程通常分三个关键步骤：
水解-----衍生化-----提取
(1)采用标准曲线的最大标准浓度进行添加回收。如德国拜发和我公司AOZ试剂盒中的第6个标准点4.05ppb，AMOZ试剂盒中的第6个标准点8.1ppb。因为这些标准品是已经过衍生化后的标准品，不能代表样本前处理实验中的加酸水解和加衍生化试剂衍生这两个步骤，所以就算回收率很高，但失去了实际参考价值。
（2）完全依赖未衍生的代谢物标准品进行添加回收。因部分未衍生的代谢物在配制成标准品后有一定的有效期，会存在潜在的不稳定因素，而且添加回收仅能考证衍生化和提取两个关键点，不能验证从组织蛋白中水解呋喃类代谢物的过程，因此也有一定的局限性。
最好的评价方案：采用经LC-MS-MS确证的阴阳性样品，留作质控样品，对检测的样本和试剂盒进行质量评价。这也是实验室所出数据可信度最具说服力的关键点。

4、 酶标分析过程中的注意事项
样本的检测是基于抗原抗体的反应，根据标准曲线，判定样本最终的药物含量。它要求加样的准确性和洗板的一致性。在整个加样的过程中注意实验室温度的恒定，保证反应在试剂盒所示的温度下进行。
4.1常见加样方式
A、吸一打二
B、吸二打一
在实际操作过程中，提倡用“吸二打一”用这种方式，有如下几个好处：
a、加样过程中在板孔内不出现或者很少出现气泡
b、提高加样速度，缩短前后样本反应的时间差。
在加样的过程中还应细心注意避免出现下列现象：
A、加样的过程中漏加或者重加；
B、加样的过程中忘记更换吸头；
C、样本的重加或者漏加；
D、忘记记录样本的加样顺序。
4.2常见的洗板方式
A、洗板机洗板；
B、多道孔加样器洗板；
C、多孔吸头洗板；
在洗板的过程中，确保每孔所加洗涤液量的均一，按说明书操作，不可过多，避免溢出板孔，污染其它样本；过少，则达不到洗涤的效果，容易出现曲线不成线性，花板等情况。
4.3 甩板
快速甩尽板孔内的液体，防止板孔里的液体对流或反溅回板孔中产生交叉污染。
4.4拍板
轻轻的在吸水纸上扣干板孔内的液体，而且吸水纸只能使用一次。
4.5 显色
值得注意的是，并非试剂盒中所规定的显色时间是绝对的，因为试剂盒的吸光度值会受环境中的温度、湿度、酶标板反应时所接触到的物品的导热度等有关，实验操作人员在加完显色液后，可根据颜色的深浅适当的延长或者缩短显色时间。防止出现吸光值接近或高于酶标仪的最高检测灵敏度（OD值在2.5-3.0之间），这样会间接影响到检测结果，如出现曲线前半部份梯度不明显或颠倒数值等现象，也就造成了一些假阳性或部分检测结果偏低的现象。

ELISA技术要点和常见问题
在ELISA实验前的注意事项

仔细阅读说明书确定试剂盒在有效期内按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积）标本制备要规范，每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备（贮存），尽量分装做备份。短期内无法实验者，注意低温保存准备好所有实验额外所需物品，如试管、吸头、移液器、离心机等根据检测标本数量确定所需试剂的量按说明书将所用试剂平衡至室温，配制所需试剂

DIY夹心法ELISA常见技术指南

选择抗体时最好选择一个单抗和一个多抗进行配对；若选择两个单抗，必须识别不同表位的抗体；最好从同一家公司选择抗体对。ELISA实验中为了确定最佳信号和最低背景应将捕获抗体（0.5-4μg/ml）和检测抗体（0.25-2μg/ml）在预实验中进行彼此相抗的滴定。同时，应包括在适当范围内的标准品的系列稀释。按试剂说明书常规提供的范围进行操作。标准品的配制：对于每种细胞因子应仔细阅读说明书，注意每批的细节。在使用细胞因子前，瞬时离心试剂瓶，尽可能多地收回其中的细胞因子。根据每批说明书中的细节，将冻干的细胞因子复溶。一般待测抗原标准曲线的线性范围的可通过将标准品做8次2倍系列稀释从2000pg/ml 到15pg/ml。可利用标准的ELISA操作流程、放大试剂盒、第三类试剂、或改变酶底物系统可在一定范围内提高灵敏度。为了优化灵敏度，建议过夜孵育标准品和标本。若使用过氧化物酶作为显色系统，应严禁在洗液和稀释液中加叠氮钠，叠氮钠可抑制过氧化物酶的活性。当测定混合液体中的抗原时，如血清，建议在标本稀释液中加不相干的Ig.

ELISA常见问题及处理对策

问题

可能原因

解决方法

无颜色

试剂孵育的时间没有按说明书操作。确定生物素化抗体，连接的HRP试剂或链霉亲和素-HRP使用的时间是否适当。

不同试剂盒或不同批号的试剂混用。重新检查试剂的标签，确准所有组分都属于正使用的试剂盒中的。不能混用不同试剂盒或不同批号的试剂。

漏加酶检查操作流程，注意不要漏加

HRP酶污染了叠氮钠使用新配制的试剂，禁含叠氮钠

标准品有问题（若在标本孔中有信号）按说明书检查标准品的制备使用1瓶新标准品

某一容器未洗净,残留灭活酶物质尽可能用试剂盒内容器,另觅一定要洁净、可靠

使用含血清的缓冲液配制/复溶抗体重新确认所选用的试剂

.漏加显色剂A或B加显色剂后观察一下液面高度

试剂配制/使用有误将实验重做；严格按说明书操作，每次配制和使用前看清标签。

缓冲液污染配制新新鲜的缓冲液

显色弱

超过有效期的产品可能会产生很弱的信号。检查产品的有效期

加入试剂的体积和时间有误确定所使用的每一个试剂的体积正确的和加入的时间是适当的。

试剂、样品用前未能平衡用前试剂、样品置室温平衡10分钟左右

缩短孵育时间能使实验的信号变弱。检查孵育的时间。

在温度变化的环境内孵育酶标板。确定孵育的温度，应避免温度的变化。

使用了被污染的试剂检查试剂是否被污染。

标准品/标本制备方法不规范检查标准品/标本的制备，标准品应按说明书进行复溶和稀释。低温贮存的标本避免反复冻融，严禁使用溶血标本。样品用NaN3防腐,抑制了酶的反应

显色底物制备不规范检查底物的制备，如体积是否正确，混合是否恰当充分。

检测时间不当是否在规定的时间内检测。

仪器设定不正确，滤光片不匹配。仪器是否设定正确，滤光片的使用等。

高背景（本底）

洗涤操作不规范洗板不充分，使用手工洗板常出现。最好使用洗板机，或使用洗瓶洗涤。每孔应完全充满洗涤缓冲液，倾出时应迅速。若使用洗板机，应校准并设定足够充满每孔的体积量。板的内侧不应接触设备。检查每孔是否有残留的洗液或每孔加样量的体积是否准确。在两次洗板之间加30秒的浸泡。

实验中孵育温度和时间不适当确定每一实验步骤的孵育温度和时间是否适当

酶加量过多加酶前验看移液器调节量是否准确。检查稀释度，若必要进行效价测定。

封闭不完全检查封闭液的计算量；提高封闭时间。

标本或标准品中的干扰物质做适当的对照

显色剂受光照时间较长,或污染显色剂A和B应于使用前10分钟从冰箱取出

整批样品放置时间过长,样品污染样品应保持新鲜,或低温保存,防止污染

缓冲液污染制备新鲜的缓冲液

吸头重复使用,未洗净或消毒不完全而用于加酶或显色剂吸头尽可能一次性使用

太多的信号：全部的板子变成规则的蓝色不充分的洗涤/洗涤步骤被遗漏-没结合的过氧化物酶仍有残留。最好使用洗板机充分洗涤检查孔内是否有残留的洗液或加样量是否准确。

底物溶液混合太早并转成蓝色应控制底物混合的时机并立即使用

太多的酶结合物检查稀释度，必要时进行效价测定

封板膜或试剂容器被重复使用，导致HRP残留，使TMB底物产生非特异蓝色。使用新鲜的封板膜，每步使用不同的试剂容器

缓冲液中污染金属或HRP制备新鲜缓冲液

高CV值（CV：coefficient of variation），花板

操作不慎或洗涤不充分按说明书洗板、加样、显色。洗板尤为重要，如上所述

出现干板，没有使用封板膜、封板膜重复使用确定每两步骤间，酶标板应保持湿润。使用封板膜封口，注意每步使用新鲜的封板膜。

由于操作失误或板子质量差（结合不均匀）造成包板不均匀。稀释用的PBS中不要加其它蛋白检查包被和封闭液体积、时间和试剂加入的方法。检查所使用的酶标板，使用ELISA板子（不要使用组织培养板）

移液器不准确，吸头重复使用。检查并校准移液器。每次取样必须换吸头。回顾标本的加入步骤，确保每次加样的准确性，保证吸取的液体按所设定的体积吸入和排出，连续加样时注意检查吸头，确保所加液体的体积。

样品离心处理不全,反应孔内发生凝血或残留细胞成分标本充分离心, 3000rpm 6分以上，严禁使用凝血（溶血）的标本

缓冲液污染制备新鲜的缓冲液

标准曲线可得到，但两点之间区别很差（低或平的曲线）

酶结合物不足检查稀释度，必要时进行效价测定

捕获抗体没有很好结合到板上检查所使用的酶标板，使用ELISA板子（不要使用组织培养板）稀释用的PBS中不要加其它蛋白

检测抗体不足检查稀释度，必要时进行效价测定

板子显色不足延长底物孵育实验使用推荐品牌的底物溶液

操作不慎回顾ELISA操作流程，消除任何擅自修改的程序。

标准曲线稀释度计算有误核查计算的情况，制备新的标准曲线

标准曲线很好，但是没有任何期望的阳性信号产生在标本中无相应的细胞因子使用内参对照重复实验，重新考虑实验的相应参数

标本基质遮盖检测将标本至少做1∶2相应的稀释，或进行系列稀释观测它的恢复性

标准曲线很好，但是标本的判读值很高标本中含的细胞因子水平超过实验范围将标本做稀释并再次实验

当使用HRP酶结合物时，TMB底物加终止液后显绿色孔中的试剂显色不充分轻轻振荡板子

边缘效应

工作环境温度不均衡避免将板子在变化温度环境中孵育

漂移

实验过程中出现间断整个实验应连续操作：在实验开始前将所有标准品和标本做适当的准备

试剂没有按说明书平衡至室温在所有试剂加入孔前，确保它们已平衡至室温，除非说明书中有另外的要求。

是否可更改试剂盒 所提供的实验操作步骤？

一般厂商为确保最高的灵敏度和特异性，对试剂盒都进行了优化，为确保每一试剂盒实验的规范性应按说明书操作。

是否可混用不同试剂盒中的试剂？

不行。绝大多数试剂在每批试剂盒中是特异的，若有问题可与厂家或代理商联系。

是否可增加或减少标本的体积。

商品化的试剂盒所需加入的标本体积是优化的，应按说明书操作，不建议更改所加标本的体积。

是否可重确定自己的标准曲线的点？

可以。说明书上有建议的制备标准曲线时标准品的稀释度，可改变稀释倍数和增加曲线的点，但是必须在实验范围内，高于试剂盒中最高标准品的点和低于灵敏度以下的点是无效的。